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2022/08/03

後肢懸垂モデルラットにおける廃用性歩容変化を包括的に理解する

論文タイトル: Comprehensive Understanding of Inactivity-induced Gait Alteration in Rodents
論文タイトル（訳）: 後肢懸垂モデルラットにおける廃用性歩容変化を包括的に理解する
DOI: 10.3791/63865
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (185), e63865
著者名（敬称略）: 太治野純一（筆頭）、伊藤　明良（連絡）　他
所属: オハイオ州立大学ウェクスナーメディカルセンター
 京都大学大学院医学研究科　人間健康科学系専攻

抄訳

生体における廃用性変化は筋や骨の萎縮にとどまらず、動作の質的変化にも及ぶことが知られている。これらの動作変化を包括的に評価するため、ビデオ画像の3次元動作解析が近年用いられるようになった。しかし、統一された指標や評価基準は確立されておらず、同手法の普及を妨げる一因となっている。
そこで本論文では、3次元動作解析の手順を普遍的な形で示すことを目的に、後肢懸垂モデルラットの歩行動作解析を実施した。
Wistarラットを尾部懸垂によって後肢を免荷する懸垂群と通常飼育の対象群に分け、介入2週間後のトレッドミル上の歩行を3次元動作解析装置を用いて評価した。対象群と較べ、懸垂群では立脚相における膝・足関節の過伸展および股関節高位を示した。
3次元動作解析は客観性など利点が多い反面、検者によって実験手順が異なるなど普遍的な用法の周知は不足している。同手法の普及のためには、個別応用の元となる汎用性の高い基礎的知見が多く共有されることが望まれる。

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2022/07/19

生体内二光子イメージング法によるマウス海馬ミクログリアの慢性観察

論文タイトル: In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus
論文タイトル（訳）: 生体内二光子イメージング法によるマウス海馬ミクログリアの慢性観察
DOI: 10.3791/64104
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (185), e64104
著者名（敬称略）: 亀井　亮佑、岡部　繁男　他
所属: 東京大学大学院医学系研究科　神経細胞生物学

抄訳

脳の免疫細胞であるミクログリアは、シナプス可塑性や神経活動を調節し、神経回路の維持に寄与している。近年、ミクログリアの脳領域ごとの不均一性が注目され、特に海馬では、神経回路の発達やその記憶に関連した機能に、ミクログリアによるシナプスリモデリングが関与しているようだ。海馬ミクログリアの挙動を生体内で観察する意義は大きいが、手術により生じる炎症が問題となる。
本論文では、マウス海馬CA1全層のミクログリアを、生体内で慢性的に二光子観察する方法を解説する。この方法では、術直後の炎症は数週以内に鎮静化し、以降1か月以上にわたって、静止型ミクログリアの突起の形態変化を解析することができる。ラミファイド型ミクログリアの長期かつ高分解能なイメージングには、手術侵襲の最小化とイメージング手法の最適化が肝要である。神経細胞とミクログリアとの二色イメージング法も提示し、海馬の複数細胞種の相互作用の観察基盤を提供する。本手法により、海馬におけるミクログリア機能の解明が進展することが期待される。

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2022/07/08

植物透明化技術によるイネの芽や茎の深部の蛍光観察

論文タイトル: Deep Fluorescence Observation in Rice Shoots via Clearing Technology
論文タイトル（訳）: 植物透明化技術によるイネの芽や茎の深部の蛍光観察
DOI: 10.3791/64116
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (184), e64116
著者名（敬称略）: 新美陽子　水多陽子　他
所属: 名古屋大学大学院生命農学研究科
名古屋大学高等研究院・トランスフォーマティブ生命分子研究所

抄訳

　近年、屈折率の均一化や自家蛍光物質の除去によって、生物体内の構造を保ったまま立体的に観察する透明化技術が開発されている。しかしイネでは、根や葉など薄い組織の観察のみにとどまっていた。その原因として、茎など硬く厚い組織や、茎頂など撥水性の葉に包まれた組織は透明化溶液が浸透しにくいといった点が挙げられる。
　そこで本論文では、プロトコルの最適化をおこない、適切な組織固定ののちにビブラトームで目的部位以外を取り除き、透明化試薬に浸漬した。その結果、透明化試薬の浸透性および均一性が向上し、さらに処理時間が短縮された。共焦点顕微鏡で観察したところ、茎から茎頂、そして幼穂までの内部構造を広視野、かつ連続的に観察することができた。
　本手法はイネだけでなく、硬くて厚い組織や層構造を持つ植物など、これまで透明化が困難であった他の植物にも有効であると考えられる。

【図の説明】
イネの形質転換体の幼穂（左）から茎基部（右）までの蛍光画像。黄色のシグナルは核に局在するOsMADS15-mOrangeの蛍光、水色のシグナルは蛍光色素で染色した細胞壁を示す。

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2022/06/30

化学物質刺激による線虫C. elegansの連合学習と記憶の形成

論文タイトル: Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans
論文タイトル（訳）: 化学物質刺激による線虫C. elegansの連合学習と記憶の形成
DOI: 10.3791/64137
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (184), e64137
著者名（敬称略）: 澁谷海大、丸山一郎　他
所属: 沖縄科学技術大学院大学情報処理生物学ユニット

抄訳

線虫C. elegansは細胞や分子レベルでの学習や記憶の研究に適したモデル生物である。その神経系は比較的単純で、全てのニューロンの化学的・電気的シナプスによる繋がりが連続超薄切片の電子顕微鏡画像から再構成されている。本論文では、プロパノールと塩酸をそれぞれ条件刺激、無条件刺激としてC. elegansに学習させ、短期記憶と長期記憶を形成させる方法を詳述する。C. elegansはプロパノールに引き寄せられ、塩酸を避ける性質がある。ところが、プロパノールと塩酸を同時に連合学習させると、C. elegansはプロパノールに引き寄せられなくなる。さらに、短期記憶と長期記憶形成の両方に、NMDA受容体が必須であることが、C. elegans突然変異体の解析から判明した。C. elegansでは６種類の介在ニューロンでのみNMDA受容体が発現していることから、これらの介在ニューロンが形成するネットワークに記憶が保存されていると考えられる。

介在ニューロンAVAを蛍光タンパク質でラベルしたC. elegans

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2022/06/29

前核期胚顕微注入でのノックインマウスおよびFloxマウスの作製

論文タイトル: Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice
論文タイトル（訳）: 前核期胚顕微注入でのノックインマウスおよびFloxマウスの作製
DOI: 10.3791/64161
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (184), e64161
著者名（敬称略）: 谷本陽子、三上夏輝　他
所属: 筑波大学生命科学動物資源センター
 筑波大学トランスボーダー医学研究センター
 筑波大学実験動物学研究室

抄訳

CRISPR-Cas技術の発展は、迅速かつ容易な遺伝子改変マウスの作製を可能にした。特にノックアウトマウスや点変異マウスは、マウス前核期胚に電気穿孔でCRISPR因子（および一本鎖DNAドナー）を導入する簡便な方法で作出できる。その一方、1000塩基対以上の遺伝子カセットノックイン(KI)マウスやFloxマウスは、主にCRISPR因子と二本鎖DNAドナーを前核期胚に顕微注入することで作製される。
筑波大学生命科学動物資源センターは、日本を含む数カ国の大学・研究所・製薬会社からの依頼を受けて、これまでに200種類以上の遺伝子カセットKIマウス系統と110種類以上のFloxマウス系統を前核期胚顕微注入法で作製してきた。これらのゲノム編集マウス作製プロジェクトには、BALB/c・C3H/HeJ・C57BL/6Nなどの近交系マウスを用いたものもあるが、そのほとんどはC57BL/6J近交系マウスを用いたものである。電気穿孔法と異なり、様々な近交系マウスの前核期胚顕微注入は容易ではない。しかし、単一近交系遺伝背景の遺伝子カセットKIマウスやFloxマウスは、遺伝子ヒト化マウス・蛍光レポーターマウス・コンディショナルノックアウトマウスモデルにおいて極めて重要である。そこで本論文では、C57BL/6Jマウスの前核期胚にCRISPR因子と二本鎖DNAドナーを顕微注入し、遺伝子カセットKIマウスおよびFloxマウスを作製するためのプロトコルを紹介する。更に、過排卵誘発や胚移植などの周辺技術と作製タイムラインについても概説する。

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2022/05/20

メゾスコピックスケールからミクロスコピックスケールの神経細胞イメージングに対応した組織透明化技術

論文タイトル: A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales
論文タイトル（訳）: メゾスコピックスケールからミクロスコピックスケールの神経細胞イメージングに対応した組織透明化技術
DOI: 10.3791/63941
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (183), e63941
著者名（敬称略）: 山内健太（筆頭著者）、日置寛之（連絡著者）
所属: 順天堂大学大学院医学研究科脳回路形態学講座　（山内健太、日置寛之）

抄訳

我々は、メゾスコピックスケールからミクロスコピックスケールの組織構造の可視化に強みを持つ組織透明化技術、ScaleSF法の開発に成功している(Furuta, Yamauchi et al., iScience; 25:103601)。ScaleS法の改変法であるScaleSF法は、組織透明化に必要不可欠な反応以外を削ぎ落とすことにより組織の透明化と組織構造の保持の両立を可能とした。ScaleSF法では、三つの水溶性溶液と反応させることにより、1 mm厚の脳組織を15時間以内に透明にすることができる。本論文では、ScaleSF法を用いたメゾスコピックからミクロスコピックのスケールの神経細胞のイメージングの詳細を動画付きで紹介する。本論文で示す一連の手法は、神経回路構造を解き明かし、神経系の情報処理基盤を明らかにする上で極めて有用である。

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2022/05/19

ポリエチレンイミンナノパーティクルによるmicroRNA-mimic/inhibitorの腎へのデリバリーおよび治療効果

論文タイトル: Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models
論文タイトル（訳）: ポリエチレンイミンナノパーティクルによるmicroRNA-mimic/inhibitorの腎へのデリバリーおよび治療効果
DOI: 10.3791/63302
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (183), e63302
著者名（敬称略）: 矢内克典、森下義幸
所属: 自治医科大学附属さいたま医療センター腎臓内科

抄訳

【背景】microRNA(miRNA)は腎障害進展に関与し、人工合成したmiRNA-mimic/ inhibitorは腎臓病の新規遺伝子治療になる可能性がある。本研究ではカチオン性ポリマーのポリエチレンイミンナノパーティクル[(PEI-NPs(non-viralキャリア)]を用いて、代表的な腎疾患モデルマウス（糖尿病性腎症、片側尿管狭窄誘導腎線維化、虚血再灌流AKI）においてPEI-NPsのmiRNAの腎へのデリバリー効果と、標的miRNAのoverexpression/knockdownおよび腎疾患治療効果について検討した。
【方法】PEI-NPsとCy3標識miRNA複合体を作成し、miRNAのデリバリー効果を蛍光顕微鏡で検討した。次にmicroarray、過去の報告、データベース（miRbase）から選出した、治療効果が期待できると予想したPEI-NPs-miRNA-mimic/inhibitor (N/P比=6)を各腎疾患モデルに尾静脈投与し、腎でのmiRNAのoverexpression/knockdown効果をqRT-PCRで検討し、治療効果を組織、qRT-PCR、免疫染色、microarray、Western blottingで検討した。
【結果】PEI-NPsは各腎疾患モデルマウスでmiRNAを腎にデリバリーし、overexpression/knockdown可能であり、PEI-NPs-miRNA-mimic/inhibitorにより腎障害抑制効果を認めた。
【結語】PEI-NPsはmiRNA-mimic/inhibitorのin vivoでの腎へのデリバリーに有効であり、PEI-NPs-miRNA-mimic/inhibitorは腎疾患の新規遺伝子治療法となる。

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2022/04/06

ゼブラフィッシュ仔魚の脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学を用いたTDP-43の相転移誘導

論文タイトル: Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae
論文タイトル（訳）: ゼブラフィッシュ仔魚の脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学を用いたTDP-43の相転移誘導
DOI: 10.3791/62932
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (180), e62932
著者名（敬称略）: 浅川和秀　他
所属: 国立遺伝学研究所　遺伝形質研究系　発生遺伝学研究室

抄訳

神経変性疾患には、凝集したタンパク質が蓄積するという特徴と、ある特定の神経細胞のタイプが変性するという特徴がある。この二つの特徴の因果関係は、理論的には、疾患に対して脆弱な神経細胞において疾患に関連するタンパク質を相転移させることで検証可能であると考えられるが、実際にはそのような実験手法は限られている。この論文で我々は、小型熱帯魚ゼブラフィッシュの脊髄運動ニューロンにおいて、DNA/RNA結合タンパク質TDP-43の相転移を誘導することで、筋萎縮性側索硬化症（ALS）における運動ニューロンの変性をモデル化する手法を紹介する。ゼブラフィッシュ仔魚は身体組織の透明性が高いために、光を吸収すると相転移を起こす光遺伝学型TDP-43を脊髄運動ニューロンで発現させた仔魚に向かって青色のLED光を照射するだけで、TDP-43の相転移や凝集体の形成を誘導することができる。このプロトコルを用いれば、ALSに対して脆弱な細胞環境において進行するTDP-43の相転移の研究が可能になり、異常なTDP-43の相転移が、運動ニューロンや身体運動に与える影響をより詳しく解析できるようになると期待される。

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2021/12/06

キュベット型高速フラッシュ蛍光光度計（FRRf）を用いた着生期のColacium sp.の光生理測定

論文タイトル: Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer
論文タイトル（訳）: キュベット型高速フラッシュ蛍光光度計（FRRf）を用いた着生期のColacium sp.の光生理測定
DOI: 10.3791/63108
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (177), e63108
著者名（敬称略）: 風間健宏　他
所属: 神戸大学大学院　人間発達環境学研究科

抄訳

高速フラッシュ蛍光光度計（FRRf）は、様々な藻類における光化学系II（PSII）の光吸収断面積（σPSII）、最大量子収率（Fv/Fm）、実効量子収率 (Fq′/Fm′) 、非光化学消光 (NPQNSV) を測定できるが、その研究対象のほとんどが、浮遊性藻類に集中している。本論文は、キュベット型FRRfを用いた、着生期（動物プランクトンに付着した状態）の付着性藻類Colacium sp.のPSII光生理測定法について記述したものである。まず基質動物プランクトン（Scapholeberis mucronata、和名アオムキミジンコ）の個体密度が、ベースライン蛍光と、Colacium sp.のクロロフィル蛍光に与える影響について調べ、5個体/mL以下なら無視できることを示した。次に典型的な測定結果として、野外で得られた着生期Colacium sp.と、培養で得られた浮遊期Colacium sp.の測定例を示した。最後に、着生期と浮遊期それぞれの光生理に対するCaおよびMnの添加効果の例を示した。

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2021/10/07

成体マウス初代口蓋上皮細胞（ケラチノサイト）の単離と培養

論文タイトル: Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate
論文タイトル（訳）: 成体マウス初代口蓋上皮細胞（ケラチノサイト）の単離と培養
DOI: 10.3791/62820
ジャーナル名: Journal of Visualized Experiments(JoVE)
巻号: J. Vis. Exp. (175), e62820
著者名（敬称略）: 泉健次、佐田亜衣子
所属: 新潟大学大学院医歯学総合研究科生体組織再生工学分野
 熊本大学国際先端医学研究機構皮膚再生・老化学講座

抄訳

長年にわたり、上皮幹細胞に関する研究は、ヒトやマウスの皮膚を主な対象として行われてきた。口腔粘膜に位置する上皮幹細胞は、そのユニークな機能と特徴から近年注目されている。口腔粘膜上皮幹細胞は、バリア機能の維持に必須の役割を果たすとともに、再生治療への応用のための細胞ソースとしても有用である。しかし、成体マウスの口腔粘膜組織より、初代培養細胞（ケラチノサイト）を効率的に単離・培養するプロトコールがないためにin vitroでの解析が限られていた。我々は、マウス口蓋組織から口腔初代ケラチノサイトを単離するための方法を確立した。低カルシウム条件では、ケラチノサイトは増殖性あるいは幹細胞様の状態で維持され、継代数を増やしても分化は抑制された。マーカー発現解析の結果、培養した口腔ケラチノサイトは基底細胞マーカーのp63、K14、α6-integrinを発現し、分化マーカーのK13と線維芽細胞マーカーのPDGFRαは陰性であった。本培養法により、口腔粘膜上皮幹細胞の機能を研究するための下流のアプリケーションに適した、長期的に培養可能な細胞が得られた。

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後肢懸垂モデルラットにおける廃用性歩容変化を包括的に理解する

抄訳

生体内二光子イメージング法によるマウス海馬ミクログリアの慢性観察

抄訳

植物透明化技術によるイネの芽や茎の深部の蛍光観察

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化学物質刺激による線虫C. elegansの連合学習と記憶の形成

抄訳

前核期胚顕微注入でのノックインマウスおよびFloxマウスの作製

抄訳

メゾスコピックスケールからミクロスコピックスケールの神経細胞イメージングに対応した組織透明化技術

抄訳

ポリエチレンイミンナノパーティクルによるmicroRNA-mimic/inhibitorの腎へのデリバリーおよび治療効果

抄訳

ゼブラフィッシュ仔魚の脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学を用いたTDP-43の相転移誘導

抄訳

キュベット型高速フラッシュ蛍光光度計（FRRf）を用いた着生期のColacium sp.の光生理測定

抄訳

成体マウス初代口蓋上皮細胞（ケラチノサイト）の単離と培養

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