国内研究者論文紹介

抄訳

【背景】コルチゾール産生腺腫（CPA）における副腎ステロイド合成酵素のDNAメチル化によるコルチゾール合成機構はわかっていない．CPAにおけるステロイド合成酵素のDNAメチル化レベルを同定し，遺伝子発現との関連を明らかにすることを目的とした．
【方法】CPA25例と非機能性副腎皮質腺腫(NFA)6例を対象に，DNAメチル化ビーズアレイ解析とRNAシークエンス解析を行った．
【結果】CYP17A1遺伝子は，NFAに比べCPAで低メチル化を示し，転写領域2箇所のメチル化レベルが有意に低かった．また，CYP17A1遺伝子の3 領域でメチル化レベルとmRNA発現量が逆相関した．PRKACA変異CPAでは，GNAS変異CPAと比較し，CYP17A1遺伝子の低メチル化傾向を認めた．CYP17A1遺伝子のメチル化レベルとmRNA発現量を用いたクラスタリング解析で，PRKACA変異CPAはNFAおよびGNAS変異CPAと明確に区別された．
【考察】CPAでは，CYP17A1遺伝子の低メチル化がCYP17A1転写を制御し，特に，PRKACA変異CPAで，その関連が強かった．

抄訳

ヘムは生物にとって重要なタンパク質コファクターであるが遊離状態では毒にもなる。病原菌は主に宿主のヘモグロビンのヘムを鉄源として奪い増殖するが、このとき生ずる遊離ヘムの毒性を回避するためにグラム陽性細菌ではヘムに特異的なATP-binding cassette （ABC）排出ポンプ（HrtBA）が働いていると考えられている。本研究では組換え大腸菌を用いたHrtBAタンパク質によるヘム解毒、生化学的機能解析、エックス線結晶構造解析を行った。その結果、ヘムは難溶性であることから細胞膜にインターカレートして毒性を発揮するが、HrtBAの膜貫通ドメインの細胞膜外葉付近に結合すること、ATPがHrtBAの細胞質側にあるヌクレオチド結合ドメインに結合すると膜貫通ドメインのヘム結合部位が収縮してヘムが解離すること、ATP加水分解でこれらのステップがターンオーバーすることで細胞膜からヘムが汲み出されることがわかった。HrtBAを欠損したグラム陽性細菌は血液中では増殖が抑制されることから本研究による生化学アッセイや立体構造に基づく阻害剤スクリーニングはグラム陽性細菌によって引き起こされる敗血症や髄膜炎の予防、治療に貢献できると思われる。



図。ヘム排出ポンプHrtBAが細胞膜からヘムを汲みだす出すモデル
ATPが結合していない時（フリー型）ではHrtB膜貫通ヘリクスが横にずれていて、細胞膜にあるヘムが膜貫通ヘリクスに結合する（ヘム型）。ヘムが細胞膜外葉付近に結合していることがわかる。このあと、ATPがHrtAサブユニットに結合すると、膜貫通ヘリクスが縮小してヘムが追い出される。ボールモデルはヘムを認識するアスパラギン酸で、ヘムが配位するとATP加水分解活性が上昇する働きに必要なアミノ酸である。

抄訳

SGA性低身長症 (SGA-SS) の原因は、インプリンティング疾患 (IDs)、病的コピー数異常 (PCNVs)、成長に関連する遺伝子の病的遺伝子バリアントなど、多岐に渡るが、これらを包括的に検討した報告は非常に少ない。
本研究では、原因不明SGA-SS 140例に対し、はじめに臨床像評価とメチル化解析を実施し、IDs 46例 (Silver-Russell症候群 42例、その他のIDs 4例) を除外した。次に、十分な検体量を有する86例に対してarray Comparative Genomic Hybridization解析、次世代シーケンシングを実施し、PCNVs 8例、候補遺伝子バリアント 11例 (pathogenic 5例、Variants of unknown significance 6例) を同定した。
本研究は、IDsを除いたSGA-SSにおけるPCNVsおよび病的遺伝子バリアントの正確な寄与を明確にした。

抄訳

脳の免疫細胞であるミクログリアは、シナプス可塑性や神経活動を調節し、神経回路の維持に寄与している。近年、ミクログリアの脳領域ごとの不均一性が注目され、特に海馬では、神経回路の発達やその記憶に関連した機能に、ミクログリアによるシナプスリモデリングが関与しているようだ。海馬ミクログリアの挙動を生体内で観察する意義は大きいが、手術により生じる炎症が問題となる。
本論文では、マウス海馬CA1全層のミクログリアを、生体内で慢性的に二光子観察する方法を解説する。この方法では、術直後の炎症は数週以内に鎮静化し、以降1か月以上にわたって、静止型ミクログリアの突起の形態変化を解析することができる。ラミファイド型ミクログリアの長期かつ高分解能なイメージングには、手術侵襲の最小化とイメージング手法の最適化が肝要である。神経細胞とミクログリアとの二色イメージング法も提示し、海馬の複数細胞種の相互作用の観察基盤を提供する。本手法により、海馬におけるミクログリア機能の解明が進展することが期待される。

抄訳

目的：本研究は患者から前向きに収集されたreal world dataを解析することにより、切除可能大腸癌における次世代シーケンサー（NGS）を用いた遺伝子パネル検査の意義について評価することを目的とした。
方法：2018年7月から2020年2月までに当院で根治手術を受けた大腸癌患者107名を対象とし、NGSデータと臨床病理学的所見との相関を評価した。
結果： ステージは、Iが28例（26.2％）、IIが40例（37.4％）、IIIが32例（29.9％）、IVが7例（6.5％）であった。病的意義のあるactionable遺伝子は97.2%の症例に認められた。共発現解析により、TP53とAPC遺伝子変異は早期癌でより頻繁に見られた。コピー数変化（CNA）は、右側結腸と早期癌で有意に少なかった。相同組換え修復欠損（HRD）は進行癌でより多く同定され、高HRDは高リスクステージIIの同定に有用であった。
結論：HRDは実臨床において新たな有用性を示す可能性があると考えられた。

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　近年、屈折率の均一化や自家蛍光物質の除去によって、生物体内の構造を保ったまま立体的に観察する透明化技術が開発されている。しかしイネでは、根や葉など薄い組織の観察のみにとどまっていた。その原因として、茎など硬く厚い組織や、茎頂など撥水性の葉に包まれた組織は透明化溶液が浸透しにくいといった点が挙げられる。
　そこで本論文では、プロトコルの最適化をおこない、適切な組織固定ののちにビブラトームで目的部位以外を取り除き、透明化試薬に浸漬した。その結果、透明化試薬の浸透性および均一性が向上し、さらに処理時間が短縮された。共焦点顕微鏡で観察したところ、茎から茎頂、そして幼穂までの内部構造を広視野、かつ連続的に観察することができた。
　本手法はイネだけでなく、硬くて厚い組織や層構造を持つ植物など、これまで透明化が困難であった他の植物にも有効であると考えられる。



【図の説明】
イネの形質転換体の幼穂（左）から茎基部（右）までの蛍光画像。黄色のシグナルは核に局在するOsMADS15-mOrangeの蛍光、水色のシグナルは蛍光色素で染色した細胞壁を示す。

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甲状腺ホルモン脱ヨード酵素には、DIO1、DIO2、DIO3の3種類があり、甲状腺ホルモンの活性化あるいは不活化を行っている。本研究ではDIO1、DIO2、DIO3それぞれについて新規調節因子を探索するため、2480種類からなる化合物ライブラリーに対しスクリーニングを実施した。プロモーターアッセイを基盤とした独自のハイスループットアッセイを構築し、プロモーター特異性の確認、細胞毒性の除外、再現性・用量依存性の確認を経て、ヒット化合物を確定した。ヒット化合物について、我々の診療科のコホートの後ろ向き解析を用いた検証に進んだ。具体的には、ヒット化合物内服前後の甲状腺機能の測定結果が存在した症例を解析し、アドレナリン受容体作動薬であるリトドリン、PDE5阻害薬であるタダラフィル、複数のチロシンキナーゼ阻害薬の内服によって有意な甲状腺機能の変化が見られた。マウスへの投与実験も行い、リトドリンは甲状腺におけるDIO2の発現を増加させ、コホート研究の結果と同様に遊離T3/遊離T4比を上昇させることを明らかとした。さらには、本論文で提示したヒット化合物のリストから新たな研究への着想が生まれると期待される。

抄訳

線虫C. elegansは細胞や分子レベルでの学習や記憶の研究に適したモデル生物である。その神経系は比較的単純で、全てのニューロンの化学的・電気的シナプスによる繋がりが連続超薄切片の電子顕微鏡画像から再構成されている。本論文では、プロパノールと塩酸をそれぞれ条件刺激、無条件刺激としてC. elegansに学習させ、短期記憶と長期記憶を形成させる方法を詳述する。C. elegansはプロパノールに引き寄せられ、塩酸を避ける性質がある。ところが、プロパノールと塩酸を同時に連合学習させると、C. elegansはプロパノールに引き寄せられなくなる。さらに、短期記憶と長期記憶形成の両方に、NMDA受容体が必須であることが、C. elegans突然変異体の解析から判明した。C. elegansでは６種類の介在ニューロンでのみNMDA受容体が発現していることから、これらの介在ニューロンが形成するネットワークに記憶が保存されていると考えられる。

介在ニューロンAVAを蛍光タンパク質でラベルしたC. elegans

抄訳

CRISPR-Cas技術の発展は、迅速かつ容易な遺伝子改変マウスの作製を可能にした。特にノックアウトマウスや点変異マウスは、マウス前核期胚に電気穿孔でCRISPR因子（および一本鎖DNAドナー）を導入する簡便な方法で作出できる。その一方、1000塩基対以上の遺伝子カセットノックイン(KI)マウスやFloxマウスは、主にCRISPR因子と二本鎖DNAドナーを前核期胚に顕微注入することで作製される。
筑波大学生命科学動物資源センターは、日本を含む数カ国の大学・研究所・製薬会社からの依頼を受けて、これまでに200種類以上の遺伝子カセットKIマウス系統と110種類以上のFloxマウス系統を前核期胚顕微注入法で作製してきた。これらのゲノム編集マウス作製プロジェクトには、BALB/c・C3H/HeJ・C57BL/6Nなどの近交系マウスを用いたものもあるが、そのほとんどはC57BL/6J近交系マウスを用いたものである。電気穿孔法と異なり、様々な近交系マウスの前核期胚顕微注入は容易ではない。しかし、単一近交系遺伝背景の遺伝子カセットKIマウスやFloxマウスは、遺伝子ヒト化マウス・蛍光レポーターマウス・コンディショナルノックアウトマウスモデルにおいて極めて重要である。そこで本論文では、C57BL/6Jマウスの前核期胚にCRISPR因子と二本鎖DNAドナーを顕微注入し、遺伝子カセットKIマウスおよびFloxマウスを作製するためのプロトコルを紹介する。更に、過排卵誘発や胚移植などの周辺技術と作製タイムラインについても概説する。

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昨今カルバペネマーゼ産生腸内細菌目細菌（CPE）が世界の公衆衛生上の大きな脅威となっている。CPEの検出法としてCIM法などが知られているが、結果を得るまで１日ほど必要となる。近年、簡便かつ迅速（判定15分）にCPEを検出できるNG-Test CARBA 5が販売された。NG-Test CARBA 5はイムノクロマト法によって、臨床上重要なカルバペネマーゼであるIMP, KPC, VIM, OXA-48, NDM（Big 5）を検出できることから、臨床現場での応用が期待されている。 本研究では、臨床現場でも分離される各種薬剤耐性菌に対するNG-Test CARBA 5の精度評価を目的とした。カルバペネマーゼ産生グラム陰性桿菌116株（Big 5 107株、Big 5以外9株）とカルバペネマーゼ非産生グラム陰性桿菌48株を用いたところ、感度99.1%（106/107）、特異度100%（57/57）と非常に高い精度で判定されることがわかった。臨床現場において、NG-Test CARBA 5を最初のスクリーニングとして実施することで、迅速診断が可能となり、さらにはポイントオブケア (POCT) 検査としても有効活用されることが期待された。